Inestabilidad de microsatélites en cánceres hereditarios o esporádicos (Microsatellite instability in hereditary or sporadic cancers) – Panel hexaplex de marcadores de inestabilidad de microsatélites; mutación de gen BRAF c.1799T>A, p.V600E; hipermetilación del promotor del gen MLH1; genes MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, EPCAM, u otros 

El avance en los conocimientos de la patogénesis molecular del cáncer ha permitido conocer la importancia de las alteraciones en los mecanismos de control de la división celular, en la patogenia del cáncer. En el control de la replicación correcta del ADN celular intervienen unas proteínas de reparación de errores conocidas como proteínas MMR (DNA Mismatch Repair). Estas proteínas están codificadas por varios genes (ver después) y al mismo tiempo para su expresión celular están controladas por al menos otros dos genes: gen BRAF y promotor del gen MLH1. En los genes codificantes de las proteínas MMR existen secuencias de nucleótidos agrupadas en tándem y repetidas, conocidas como microsatélites. La inestabilidad de los microsatélites (MSI: Microsatellite Instability) implica una pérdida de control de la división celular y con ello el desarrollo de una multiplicación celular excesiva que condiciona el desarrollo de tumores. Según cuál sea el grado de alteración de los genes codificantes de las proteínas MMR, la inestabilidad de los microsatélites se denomina MSI-H (H: high/alta; poseen 2 ó más marcadores inestables) o MSI-L (L: low/baja; poseen un solo marcador inestable) para indicar el grado de inestabilidad. Cuando no existe inestabilidad de los microsatélites se dice que poseen microsatélites estables (MSS). La inestabilidad de microsatélites (MSI) tiene actualmente interés para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de varios tipos de cánceres. Los canceres con inestabilidad elevada de los microsatélites (MSI-H) muestran diferente evolución y respuesta al tratamiento respecto a los tumores con microsatelites estables (MSS). Por ello, las pruebas de microsatélites son esenciales, no sólo como pruebas genéticas para conocer su participación en la aparición de un tumor, sino que también tienen un importante valor pronóstico y predictivo de respuesta a la quimioterapia e inmunoterapia.

La inestabilidad de los microsatélites puede aparecer de forma esporádica o en un contexto hereditario como ocurre en el síndrome de Lynch (cáncer colorrectal no polipósico hereditario / Hereditary nonpolyposis colorectal cáncer –HNPCC-). Actualmente pueden diferenciarse dos fenotipos moleculares en los tumores: con estabilidad de microsatélites (MSS) y con inestabilidad de microsatélites (MSI-H o MSI-L). Los cánceres colorrectales con inestabilidad de microsatélites (MSI-H o MSI-L: dos o más marcadores inestables o un solo marcador inestable, respectivamente), tienen características clínico-patológicas distintas, apareciendo en personas más jóvenes, localización proximal, reacción linfocítica manifiesta y patrón de crecimiento medular.

Cuando existen defectos en los sistemas de reparación de ADN por pérdida de función de las proteínas MMR, pueden estar afectados muchos genes, entre los más frecuentes: MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, PMS1, EPCAM, etc. Las proteínas MMR codificadas por esos genes se expresan en los núcleos celulares y pueden detectarse por métodos inmunohistoquímicos (IHC). Cuando por métodos inmunohistoquímicos (IHC) no se observan en el interior de los núcleos celulares una o más de estas proteínas, se sugiere una deficiencia de los sistemas de reparación del ADN (MMR).

Los defectos en la expresión de los genes que codifican las proteínas MMR pueden ser hereditarios o esporádicos (no hereditarios). Cuando son hereditarios existen mutaciones en los genes que codifican estas proteínas MMR en todas las células de nuestro organismo, tisulares o células nucleadas de sangre periférica. Cuando son tumores esporádicos (no hereditarios), la expresión de las proteínas de reparación MMR se encuentra únicamente presente en las células tumorales, pero no está presente en las células de otros tejidos o en las células nucleadas de sangre periférica. Además, la alteración de la formación de las proteínas MMR puede estar causadas por mutación del gen BRAF (c.1799T>A, p.V600E) o por hipermetilación del promotor del gen MLH1, con frecuencia asociada a la mutación del gen BRAF.

En las pruebas genéticas de inestabilidad de los microsatélites (MSI-H / MSI-L), se amplifican por PCR varias secuencias del ADN extraído de tejido tumoral, comparativamente con ADN extraído de tejidos o de leucocitos de sangre periférica de cada paciente. La recomendación de Bethesda (1997) incluía el estudio de cinco marcadores para determinar la inestabilidad de los microsatélites: dos marcadores de mononucléotidos: BAT25, BAT26 y tres marcadores de dinucleótidos: D2S123, D5S346 y D17S250. Sin embargo, posteriormente, por considerarse más específicos y sensibles los marcadores de mononucleótidos, se recomendó un panel de cinco marcadores de mononucleótidos (pentaplex) (2002). Sin embargo, este último panel no detectaba algunos casos de tumores de pacientes con síndrome de Lynch, principalmente en los pacientes con mutaciones germinales en gen MSH6 o en tumores distintos del cáncer colorrectal. Por ello, se propuso un panel de seis marcadores (prueba hexaplex) con únicamente los marcadores de mononucleótidos siguientes: BAT25, BAT26, BAT40, NR21, NR22 y NR27. 

Como norma general, ante un tumor supuestamente debido a inestabilidad de microsatélites y para poder diferenciar entre su carácter hereditario o esporádico, se recomienda: 1) realizar en primer lugar la prueba de los marcadores de inestabilidad de microsatélites (panel hexaplex), y en caso de ser positiva, 2) realizar la detección de la mutación del gen BRAF c.1799T>A, p.V600E, y en caso de ser negativa, 3) hacer una prueba para detectar la hipermetilación del promotor del gen MLH1. Si las pruebas de mutaciones de los genes BRAF y MLH1 son negativas se confirmaría la naturaleza hereditaria de la alteración de inestabilidad de los microsatélites.

Las pruebas de inmunohistoquímica (IHC), aunque ligeramente menos sensibles que las pruebas genéticas, se pueden utilizar para detectar la presencia de las proteínas de reparación (MRR) MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, PMS1, EPCAM u otras en las células tumorales. Cuando existe inestabilidad de microsatélites las proteínas están ausentes, mientras que están presentes en caso contrario. Cuando falta alguna de las proteínas los tumores se pueden catalogar como deficientes en proteínas MMR, considerándose que poseen inestabilidad de microsatélites (MSI), mientras que si están presentes, se consideran de microsatélites estables (MSS) o de baja inestabilidad de micosatélites (MSI-L: Microsatellite instabilitry low). Los resultados más frecuentes de pruebas inmunohistoquímicas anormales son pérdidas de las proteínas MLH1 y PMS2, con normalidad de las proteínas MSH2 y MSH6. Las pruebas posteriores de mutación del gen BRAF c.1799T>A, p.V600E y de hipermetilación del promotor del gen MLH1, pueden diferenciar la existencia de un tumor esporádico de un tumor hereditario, como los incluidos en el síndrome de Lynch. Otros patrones que pueden encontrarse son la pérdida de las proteínas MSH2 y MSH6 o de las proteínas MSH6 o PMS2 aisladas, que son más propios del síndrome de Lynch debidos a mutaciones heredadas de células germinales. La detección de mutaciones de las líneas germinales puede realizarse en los leucocitos de sangre periférica o en biopsias de tejidos normales. El diagnóstico genético del síndrome de Lynch hereditario es importante porque estos pacientes tienen un riesgo elevado de desarrollar otros tumores, por lo que requieren una vigilancia adecuada ya que, entre otros, tienen un riesgo de desarrollar cáncer colorrectal entre el 30 a 70%, comparado con el 5% de la población general. Además, tienen un mayor riesgo de desarrollar cánceres distintos a los colorrectales, como son los de: endometrio, ovarios, intestino delgado, estómago, vejiga urinaria, riñones, vías biliares, vesícula biliar o piel, entre otros.

En los cánceres colorrectales esporádicos también pueden existir patrones de inestabilidad de microsatélites en el 12% de los casos. Ello se debe a la hipermetilación del promotor del gen MLH1 que con frecuencia se asocia con la mutación del gen BRAF c.1799T>A, p.V600E. Estas mutaciones somáticas detienen la producción de ARNm a partir del gen MLH1 y con ello la carencia de la proteína MLH1. La mutación del gen BRAF c.1799T>A, p.V600E, está presente en los tumores esporádicos con inestabilidad de microsatélites MSI-H y no se encuentra en los casos de mutaciones de células germinales, como ocurre en el síndrome de Lynch. Por ello, si se observa pérdida de las proteínas MLH1 o PMS2, debe estudiarse la mutación del gen BRAF c1799T>A, p.V600E, o el análisis del promotor del gen MLH1 para excluir los casos esporádicos. Si el tumor es deficiente en las proteínas MLH1 o PMS2 y carece de mutación somática del gen BRAF o de la hipermetilación del promotor del gen MLH1, es improbable que se trate de un tumor esporádico por inestabilidad de microsatélites y deben estudiarse la inestabilidad de microsatélites de las células germinales.

 

Pruebas realizadas en IVAMI: en IVAMI realizamos la detección de mutaciones asociadas con la inestabilidad de microsatélites de los genes MLH1, MSH2, MSH6 o PMS2, u otros si se solicita específicamente, así como de la mutación del gen BRAF c.1799T>A, p.V600E o la hipermetilación del promotor del gen MLH1. Para detectar la mutación del gen BRAF c.1799T>A, p.V600E, realizamos su amplificación por PCR y su secuenciación posterior. Para detectar la inestabilidad de microsatélites utilizamos la prueba hexaplex de seis marcadores, comparando el patrón obtenido a partir de las células del tumor con el obtenido a partir de las células de sangre periférica o de otros tejidos sanos del mismo individuo. Para detectar la hipermetilación del promotor del gen MLH1, realizamos dos amplificaciones con cebadores (primers) capaces de detectar la hipermetilación.

 

Muestras recomendadas: sangre extraída con EDTA para separación de leucocitos sanguíneos, para determinar los patrones de inestabilidad de microsatélites en los genes de procesos autosómicos dominantes, hereditarios, como el síndrome de Lynch, y como control de las muestras analizadas de tejidos tumorales. Para las muestras de sangre periférica puede enviarse tarjeta impregnada con muestra de sangre desecada (IVAMI puede enviar por correo la tarjeta para depositar la muestra de sangre). Para realizar las pruebas de marcadores de inestabilidad (prueba hexaplex), o para la secuenciación completa de los genes, se requieren muestras de biopsias tumorales, a ser posible obtenidas por microdisección de tejido tumoral (muestras frescas refrigeradas o congeladas, o cortes histológicos incluidos en parafina).


Pruebas recomendadas por IVAMI:

  1. Para inestabilidad de microsatélites (MSI), realizar el panel hexaplex (BAT25, BAT26, BAT40, NR21, NR22 y NR27) de marcadores de mononucleótidos, que detectan mutaciones en las células de un tumor, tanto esporádicas como de origen germinal (heredadas).
  2. Para inestabilidad de microsatélites (MSI) en cánceres supuestamente esporádicos, realizar pruebas de detección de mutación del gen BRAF y de detección de hipermetilación del promotor del gen MLH1.
  3. Opcional: secuenciaciones completas de genes MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, EPCAM u otros.