Triquinosis-Triquina (Trichinella spp.) – Detección en animales y alimentos: triquinoscopia, digestión artificial-concentración; Identificación de especie (PCR y secuenciación)

 

Información 15-12-17.

 

Los nematodos del género Trichinella spp. son los agentes causantes de la triquinosis, una parasitosis zoonótica de origen alimentario causada por el consumo de carne cruda o poco cocinada infectada con larvas viables localizadas en las células musculares.

Esta parasitosis constituye un riesgo para la salud del hombre, y provoca también cuantiosas pérdidas económicas en la producción mundial de alimentos. Aunque la triquinelosis es endémica en muchas regiones del mundo, el impacto predominante de las enfermedades humanas se relaciona principalmente con brotes agudos tras el consumo de productos cárnicos crudos infectados. La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) clasifica la presencia de triquinas como un riesgo medio para la salud pública en relación con el consumo de carne de porcino. Además, la triquinelosis figura en la lista de enfermedades del Código Sanitario para los Animales Terrestres de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), y por tanto, es de declaración obligada. 

Trichinella spp. es un complejo de al menos 12 taxones que presenta una distribución global. Hasta la fecha, se reconocen dentro de este género nueve especies y tres genotipos aún sin nombrar. Los taxones de Trichinella spp. están divididos en dos grupos o clados según sus larvas se encapsulen o no en los músculos de sus hospedadores. El clado de especies con cápsula infecta sólo a mamíferos, e incluye a T. spiralis (T1), T. nativa (T2), T. britovi (T3), T. murrelli (T5), T. nelsoni (T7), T. patagoniensis (T12), y los genotipos de Trichinella T6, T8 y T9. El clado de especies no capsuladas incluye a T. pseudospiralis (T4), que infecta mamíferos y pájaros; y a T. papuae (T10) y T. zimbabwensis (T11), que infectan mamíferos y reptiles. La mayor parte de las especies tienen una amplia distribución geográfica e infectan a múltiples hospedadores, sólo unas cuantas están localizadas en áreas determinadas y afectan a animales específicos. Se han identificado más de 100 especies de mamíferos, aves y reptiles como hospedadores definitivos de este parásito. La mayor parte de los hospedadores son silvestres, constituyendo el principal reservorio de Triquinella, sobre todo aquellos animales con gran actividad canibalística y carroñera. No obstante, para la triquinelosis humana, son de importancia particular los hospedadores domésticos de la enfermedad, tales como cerdos, caballos, perros, gatos y roedores.

 

Se ha demostrado que ocho de estos taxones son infecciosos para los humanos, mientras que los cuatro restantes, se consideran potencialmente infecciosos. No obstante, el principal agente etiológico de enfermedad en el humano es Trichinella spiralis. T. spiralis es la especie mejor adaptada a los cerdos (domésticos y silvestres) y la más detectada en ellos, afectando también a equinos y ratas, entre otros animales. Además, posee una distribución cosmopolita ya que los humanos la han introducido en la mayor parte de los continentes de manera pasiva a través de los animales. Otras especies de relevancia son la encapsulada T. nativa, por su amplia distribución geográfica, y T. pseudospiralis, que destaca entre las especies no encapsuladas como la única especie que puede infectar tanto a pájaros como a mamíferos.

 

Morfológicamente, Trichinella es un nematodo dioico, filiforme y pequeño. Hasta el momento, T. spiralis es el nematodo más pequeño conocido que parasita al ser humano. En estado adulto, las hembras son más grandes que los machos, midiendo 3-4 mm de longitud y unos 60 µm de diámetro, mientras que el macho mide 1,3-1,5 mm con unos 40 µm de diámetro. Los machos son más delgados en la parte anterior que en el extremo posterior, donde presentan dos apéndices caudales lobulados, una pseudobursa copulatoria. Las formas infectantes, larvas L1 en células nodriza, miden alrededor de 1,2 mm y unos 35 - 40 µm de diámetro.

El ciclo de vida de Trichinella spiralis es un ciclo autoheteroxeno, ya que todas las fases suceden dentro de un mismo hospedador que cumple un papel mixto, actuando tanto de hospedador intermediario como definitivo. En el ciclo de vida de Trichinella no existe ninguna forma evolutiva en el medio externo, tanto el ciclo como la vida de este parásito son fundamentalmente intracelulares (con excepción de las larvas migratorias), y se produce en las microvellosidades intestinales y en el tejido muscular del hospedador. La transmisión de un hospedador a otro, animal o humano, se produce a través de la ingesta de tejido muscular con larvas L1 de Trichinella enquistadas. Los animales silvestres se contagian por predación e ingestión de desperdicios; los cerdos domésticos por alimentación con restos de carne, productos de carne sin cocer, o por comer ratas; y en el hombre, por consumo de carne o de productos a base de carne insuficientemente cocidos procedentes de un animal infectado. Se contempla la existencia de dos ciclos biológicos, el ciclo doméstico y el ciclo silvestre, según lo sean los animales involucrados en la transmisión. Las principales fuentes de humanos infección son los cerdos domésticos y jabalíes. En los países desarrollados donde se ha controlado la triquinelosis en los cerdos domésticos, la infección humana se debe más frecuentemente al consumo de carne de animales de caza o de caballo. No obstante, en Europa, la EFSA reconoce la presencia esporádica de triquinas en cerdos, principalmente en aquellos criados en libertad y para el autoconsumo. Además, la mayor parte de casos en el mundo siguen siendo causados por el consumo de carne porcina insuficientemente cocida.

El ciclo comienza cuando un carnívoro come carne que contiene las larvas L1 enquistadas viables, las formas infectantes de Trichinella spiralis. Una vez en el intestino delgado del hospedador, las larvas se liberan de los quistes por medio de la acción de enzimas proteolíticas e invaden la mucosa intestinal, donde evolucionan hasta convertirse en adultos, parásitos intracelulares de un sincitio enteroepitelial. Tras la cópula, las hembras, larvíparas, ponen sus larvas durante semanas hasta que la respuesta inmune del hospedador afecta su viabilidad. La producción de larvas por parte de la hembra depende de la especie del hospedador, el grado de infestación, del estado inmunológico del huésped y, de la especie de Trichinella parásita. Transcurridas unas 6 semanas, la hembra es arrastrada con el bolo alimenticio y es eliminada con las heces. Las larvas recién nacidas, liberadas en la submucosa intestinal migran por vía sanguínea y linfática hacia otros órganos o tejidos del hospedador. Estas larvas presentan un tropismo específico por el músculo estriado, y tienen preferencia por los músculos con alta actividad y bajas tasas de glucógeno, como el diafragma, bíceps, lengua y maseteros. También, pueden invadir cualquier otro tipo de tejido, pero sólo las larvas que llegan a la musculatura estriada del hospedador madurarán y se convertirán en larvas L1. Las larvas invaden las fibras musculares, que se transforman en células nodrizas, y en el sarcolema son encapsuladas como larvas L1, formando un quiste donde la larva muscular permanece viva durante años.

La infección de Trichinella en animales suele cursar sin síntomas clínicos, incluso en animales que alcanzan una alta carga parasitaria. Sin embargo, en el hombre, la triquinelosis se manifiesta como una enfermedad tóxico-infecciosa aguda, grave e inespecífica, cuyo cuadro clínico varía dependiendo de la dosis infectiva, la susceptibilidad del individuo, y posiblemente de la especie de Trichinella. La infección puede ser asintomática si involucra un número bajo de larvas. Sin embargo, en el caso de la ingestión de unos pocos cientos de larvas, a los dos días aparecerán los síntomas gastrointestinales, seguidos por el desarrollo de una enfermedad grave, aunque rara vez fatal. Los signos clínicos de la enfermedad generalmente duran de 4 a 6 meses, aunque ocasionalmente se ha reportado una duración más larga, de hasta 2 años. Las alteraciones sintomatológicas se dividen en tres etapas sucesivas: la fase intestinal, de migración, y de estado. En la fase intestinal, las manifestaciones clínicas se deben a los nematodos creciendo e invadiendo las vellosidades intestinales y se presentan tras un periodo de incubación que oscila entre 2 y 10 días tras la ingesta de carne contaminada con larvas. Los síntomas consisten en dolor abdominal, diarrea, malestar general, fatiga, hiporexia, nauseas, vómitos y fiebre, que persisten durante de 10 a 12 días. La fase sistémica, de migración e invasión muscular, se manifiesta aproximadamente 5 días más tarde, aunque puede manifestarse en un periodo de entre 1 y 6 semanas tras la infección. A medida que las larvas migran a los músculos, causan dolor agudo, cefalea, fiebre elevada, edema periorbital y facial, fotofobia, escalofríos, tos, lagrimeo, dolor en las articulaciones y en los músculos, rigidez muscular, erupciones cutáneas, hemorragias conjuntivales y subungueales, fatiga, pérdida de peso, y diarrea o estreñimiento. Aunque las larvas pueden penetrar en multitud de células, las que lesionan con más gravedad son las del músculo cardíaco, cerebro y retina. Si el músculo afectado es el diafragma se produce hipo y dolor al respirar. La manifestación más grave en esta fase es la miocarditis, que puede llegar a producir la muerte. La invasión de las larvas al sistema nervioso central origina cefalea, insomnio, irritabilidad, apatía, vértigo, y datos meníngeos. Finalmente, en la fase de estado, las larvas ya se han establecido en el músculo y el síntoma predominante es el dolor muscular que se exacerba con el ejercicio. Con el tiempo, los síntomas desaparecen y la pared quística se calcifica. 

Pruebas de laboratorio disponibles

Las pruebas de diagnóstico para la detección de Triquinella spp. son de vital importancia para eliminar los animales infectados de la cadena alimenticia y prevenir la enfermedad en humanos. En Europa, el Reglamento (CE) nº 2015/1375 establece las normas específicas para los controles oficiales de la presencia de triquinas en la carne. Las pruebas de diagnóstico se agrupan en dos categorías: métodos directos e indirectos.

Los métodos directos se basan en la detección de la larva, enquistada o libre, en tejido de músculo estriado. Las larvas de Trichinella normalmente se localizan en mayores concentraciones en los músculos preferidos, que varían según la especie hospedadora. Es importante muestrear dichos músculos preferidos para maximizar la sensibilidad. Por ejemplo, los músculos de interés parasitológico y los que concentran la mayor cantidad de larvas de T. spiralis en la especie porcina, son el diafragma, lengua, maseteros e intercostales, mientras que, en los jabalíes, los músculos preferidos incluyen la pata delantera, la lengua o el diafragma; y en los caballos, los músculos de la lengua suelen hospedar la mayoría de los parásitos, seguidos por el masetero, el diafragma y los músculos del cuello.

El método de compresión o triquinoscopia consiste en la observación al microscopio de la muestra de músculo colocada entre dos portaobjetos fuertemente unidos, con el fin de detectar quistes calcificados con larvas en su interior. La triquinoscopia es un método poco sensible y no es recomendable como prueba fiable para la inspección de las canales, ni en cuanto a inocuidad alimentaria, ni en cuanto a vigilancia de las infecciones. Además, el examen triquinoscópico no consigue detectar las especies de Trichinella no encapsuladas que infectan a animales domésticos, salvajes, y a seres humanos. Por todo ello, no es considerado un método adecuado de detección por la legislación europea (Reglamento nº 2015/1375). Sin embargo, debido a su sencillez, puede usarse como método complementario.

Los métodos de digestión artificial incluyen la digestión enzimática de muestras de tejido muscular individuales o agrupadas, y utilizan la homogeneización o trituración mecánica, la agitación y la incubación. Posteriormente, mediante procedimientos de filtración y sedimentación se recuperan y concentran todas las larvas que se hayan liberado del músculo durante la digestión. Las muestras procesadas con estos métodos se someten a un examen estereomicroscópico para comprobar la presencia de larvas. Los métodos de digestión son más sensibles que la triquinoscopia, con ellos se puede detectar < 1 larva por gramo de tejido. Las principales limitaciones de la técnica son los posibles bajos niveles de infección, la cantidad de músculo digerido, la desigual distribución de las larvas dentro de los tejidos, y la escasa digestibilidad de ciertos tejidos y de las muestras de fauna salvaje que han sido congeladas. Por ello, si no puede extraerse la muestra en el sitio preferido o si el tipo o la especie de animal tienen un riesgo superior de infección, el Reglamento (CE) nº 2015/1375 pauta aumentar el tamaño de las muestras para el análisis parasitario, tales como un mínimo de 3–5 g en el caso de los cerdos y 5–10 g en el caso de los caballos, animales de caza. Este Reglamento señala la digestión artificial como método de referencia de uso rutinario para el análisis de muestras  individuales y colectivas.           

Los métodos indirectos para la detección de la infección por Triquinella, pueden ser de diferentes tipos, pero las pruebas serológicas son las que se emplean con mayor frecuencia. La sensibilidad y la especificidad de los métodos serológicos dependen sobre todo del tipo y de la calidad del antígeno utilizado. La mayoría de los datos relativos a la realización y validación de las pruebas serológicas provienen de su aplicación a los cerdos. La legislación europea vigente dicta que los ensayos serológicos pueden ser útiles para la vigilancia si han sido validados por un laboratorio de la UE de referencia, designado por la Comisión. Las pruebas serológicas son aceptables para el seguimiento o verificación de piaras libres de Triquinella. Sin embargo, los ensayos serológicos no son adecuados para detectar la presencia de triquinas en animales individuales destinados al consumo humano.

Por último, las técnicas de biología molecular para genotipificación han permitido confirmar la actual clasificación taxonómica. Además, se han descrito diferentes protocolos para la detección de Trichinella en carne mediante la amplificación específica de su ADN mediante PCR. No obstante, actualmente el uso de esta técnica es mayoritariamente epidemiológico. Las diferentes especies y genotipos del género Trichinella spp. son morfológicamente indistinguibles, y su identificación se basa en el uso de ensayos bioquímicos o moleculares. El aislamiento de larvas de Trichinella de músculos de animales infectados permite la identificación de larvas a nivel de especie o genotipo con el fin de obtener información epidemiológica valiosa para controlar estos patógenos zoonóticos. 

Pruebas ofertadas por IVAMI:

  • Prueba de examen microscópico directo (triquinoscopia), con examen de 5 fracciones de 1 g por cada pieza cárnica recibida.
  • Examen microscópico tras digestión pépsica durante 24 horas de pieza cárnica individual (de 30 g), o colectivas (hasta 100 g de muestras a la vez).
  • Identificación de especie del género Triquinella spp. (PCR y secuenciación). 

Muestras requeridas:

Para las muestras de cerdo, se recomiendan muestras de músculo de (por orden de interés) diafragma, lengua o base de lengua, maseteros derecho o izquierdo, intercostales derechos o izquierdos, paletilla, pata, y lomo. Según el tipo de muestra y análisis existen diferentes especificaciones:

  • Cuando se trate de canales enteras de cerdos domésticos, deberá tomarse una muestra de un peso mínimo de 1 g en uno de los pilares.
  • En el caso de las cerdas de cría y los verracos, deberá tomarse una muestra mayor de un peso mínimo de 2 g en uno de los pilares del diafragma, en la zona de transición entre la parte muscular y la parte tendinosa.
  • Cuando no se disponga del pilar del diafragma, deberá tomarse una muestra de doble tamaño, 2 g (o 4 g en el caso de las cerdas de cría y los verracos), de la parte del diafragma situada cerca de las costillas o del esternón, o de los maseteros, la lengua o los músculos abdominales.
  • Para los trozos de carne, se tomará una muestra de un peso mínimo de 5 g de músculo estriado, que contenga poca grasa y, a ser posible, que esté situado cerca de los huesos o de los tendones.
  • En el caso de las muestras congeladas, se tomará para analizar una muestra de un peso mínimo de 5 g de músculo estriado.

Cuando se deseen analizar otros animales, deberán tomarse muestras de mínimo 10 g de la pata delantera, la lengua o el diafragma de los jabalíes; los músculos de la lengua o de los maseteros de los caballos; muestras del diafragma, el músculo masetero y la lengua en los osos; músculos de la lengua para la morsa; los músculos maseteros, pterigoideos e intercostales en cocodrilos; y los músculos de la cabeza en el caso de las aves. 

Plazo de entrega de resultados:

  • Para triquinoscopia y digestión artificial de las muestras: 2 días.
  • Para la identificación molecular a nivel de especie: 4-5 días. 

Condiciones de conservación y envío de las muestras 

Las muestras deben conservarse refrigeradas y enviarse al menos en condiciones que garanticen la refrigeración durante el transporte. La muestra debe introducirse en un recipiente de seguridad biológica o frasco de plástico flexible (polipropileno), y debe enviarse con refrigeración en una caja de poliestireno expandido (corcho blanco), con un acumulador de frío. La muestra, a ser posible no debe haberse congelado previamente. Si se ha congelado, advertirlo en la solicitud.  

Coste de las pruebas:

  • Coste por muestra recibida con ambos métodos para muestras individuales: consultar a ivami@ivami.com.
  • Para muestras recibidas simultáneamente en grupos de 5 ó más muestras para ambos métodos (cada una): consultar a ivami@ivami.com.
  • Para análisis de muestras colectivas por el método de digestión (hasta 100 g); consultar a ivami@ivami.com.
  • Identificación molecular de la especie de Triquinella spp.: consultar a ivami@ivami.com.