Colifagos en aguas: indicadores virales alternativos a los indicadores bacterianos. Métodos cualitativo y cuantitativo (EPA 1601 y 1602, para colifagos somáticos y F+).
(EPA, Método 1601: 2001. Male-specific (F+) and Somatic Coliphage in Water by Two-step Enrichment Procedure) (EPA, Method 1602: 2001. Male-specific (F+) and Somatic Coliphage in Water by Single Agar Layer –SAL- Procedure)
Información 07-04-16.
Las aguas dulces continentales y las aguas marinas pueden contaminarse con excretas humanas y de animales. Las excretas humanas pueden contener virus entéricos patógenos como Enterovirus, Adenovirus, y Norovirus que pueden causar brotes o casos aislados de gastroenteritis aguda, hepatitis infecciosa (hepatitis A) y otras enfermedades. Los virus entéricos humanos pueden sobrevivir tras el tratamiento de las aguas residuales mejor que otros indicadores de contaminación fecal y bacterias patógenas, y con frecuencia el tratamiento de las aguas residuales es inadecuado para prevenir la contaminación de aguas marinas, así como la bioacumulación de en moluscos bivalvos que los ingieren.
Las aguas negras pueden contener bacterias y virus causantes de enfermedades, además de indicadores fecales inocuos como son algunas bacterias entéricas y bacteriófagos. Los bacteriófagos pueden utilizarse como indicadores fecales para conocer la calidad del agua, basado en que al controlar éstos como indicador, se controla la posible presencia de otros patógenos menos prevalentes.
Los métodos habituales para detectar bacterias indicadoras de contaminación fecal (p. ej. coliformes, Enterococcus –Streptococcus fecales-), no predicen fiablemente la presencia de virus patógenos en aguas o moluscos.
El indicador fecal más común en las pruebas de aguas son las bacterias coliformes y Escherichia coli. Sin embargo, otras bacterias como los Enterococcus spp. y unos virus bacterianos como los colifagos (bacteriófagos de Eschericha coli) se han reconocido como marcadores de contaminación fecal equivalentes a Escherichia coli. Los colifagos son virus bacterianos y algunos de ellos son estructuralmente similares a los virus entéricos patógenos (con una cubierta proteica similar a la capside de los virus entéricos), junto a un genoma de ADN o de ARN monocatenario (ss) o bicatenario (ds). Algunos de los colifagos son llamados colifagos “machos” o F+, por infestar a la bacteria a través de los pili sexuales que poseen las bacterias “macho” (F+). Estos colifagos son morfológicamente similares a los virus entéricos y tienen una resistencia similar a los tratamientos químicos del agua. Entre este tipo de colifagos se encuentran los Leviviridae (ssRNA, 24 nm de diámetro, fago MS2), y los Inoviridae (ssDNA, 810 x 6 nm, fago fd). Otros colifagos son llamados colifagos somáticos o F-, porque no requieren la presencia de pili sexuales para infectar a la bacteria, y la infectan a través del contacto con la pared celular bacteriana. Entre estos se encuentran los Myoviridae (dsDNA, 95 x 65 nm, fago T2), los Styloviridae (dsDNA, 54 nm, fago λ), los Podoviridae (dsDNA, 47 nm, fago T7), y los Microviridae (ssDNA, 30 nm, fago ΦX174).
Los colifagos se eliminan con las excretas fecales y no se replican en el agua, a menos que se encuentren presentes las bacterias coliformes, por lo que son un indicador útil de contaminación fecal. Por ello, se consideran un buen indicador para determinar el riesgo viral en un suministro de agua. Se ha demostrado que el seguimiento de colifagos puede ser una herramienta útil para el seguimiento y control de los niveles bajos de contaminación, sobre todo en las aguas tratadas con cloro, ya que los colifagos poseen una resistencia al cloro superior a la de los Enterovirus, como es el caso del Poliovirus tipo 1.
La detección de colifagos es una alternativa a los indicadores bacterianos de contaminación del agua, ya que son unos indicadores de contaminación fecal, y al mismo tiempo de la posible presencia de virus de transmisión entérica como los de hepatitis infecciosa –hepatitis A-, Norovirus, u otros Enterovirus, por lo que actualmente la detección de los colifagos, se considera un indicador de calidad del agua. La contaminación biológica más frecuente procede de las aguas residuales contaminadas con excretas humanas o de animales.
Métodos de detección de colifagos
El método EPA 1601, es un método cualitativo (presencia o ausencia) de enriquecimiento en dos fases, que utiliza dos tipos de bacterias hospedadoras para determinar la presencia de ambos grupos de colifagos (F+ y somáticos), citados previamente. Tras un periodo de incubación del agua en presencia de las bacterias indicadoras, las muestras deben depositarse sobre una capa de crecimiento bacteriano específica para cada tipo de fago, que son incubadas y examinadas para determinar la presencia de zonas circulares de lisis. Este método se considera el más sensible para excluir la presencia de colifagos en una muestra de aguas. El método EPA 1602 utiliza un ensayo en una sola etapa y permite cuantificar la cantidad de colifagos presentes.
Se han recomendado varios métodos (tratamiento del agua con cloroformo, filtración del agua por membrana, tratamiento del agua con sustancias detergentes, …), para tratar de eliminar la posible flora bacteriana acompañante presente en el agua, que pueden interferir con el desarrollo de las cepas indicadoras de Escherichia coli, o que impidan la visualización de las áreas de lisis causadas por la replicación de los colifagos. Sin embargo, todos los métodos recomendados reducen en cierta medida la detección de colifagos, por lo que no deben usarse si se pretende detectar cantidades pequeñas de colifagos.
Así mismo, se han propuesto varios métodos para concentrar los colifagos en muestras de aguas, adsorción a hidroxiapatita y elusión con fosfato sódico, filtración por resinas de intercambio iónico y adsorción a filtros con microporos, adsorción con filtros de microporos y elusión con extracto de carne, etc.). No obstante estos métodos no son adecuados para concentrar colifagos por su sensibilidad a los niveles de pH, que se utilizan en algunos de los métodos para realizar la adsorción. Estos métodos están basados en que a pH bajo los virus poseen cargas positivas y se adhieren a las membranas con carga negativa; al mismo tiempo para conseguir su elusión de las membranas se requiere un pH elevado. Estos cambios de pH extremos puede dañar los colifagos y hacer que no sean detectados con los métodos basados en su replicación.
En general, para poder realizar una determinación cuantitativa es necesario preparar diluciones seriadas de la muestra de agua e inocular por duplicados las diluciones sobre placas con la bacteria indicadora. No obstante, dado que se considera que no debe detectarse la presencia de colifagos, el método EPA 1601, recomienda no diluir la muestra y realizar la exposición de 100 mL de agua a cada una de las dos cepas de Escherichia coli indicadoras y al medio de cultivo, para preparar con ello una serie de placas de medio sólido que permitirá determinar la ausencia de colifagos de cualquiera de los dos grupos.
El límite establecido es de 0 colifagos en 100 mL de agua de bebida.
Pruebas realizadas en IVAMI
- Prueba cualitativa para detección de colifagos F+ (machos) y somáticos (F-), según norma EPA 1601: 2001.
- Prueba cuantitativa para detección de colifagos F+ (machos) y somáticos (F-), según norma EPA 1602: 2001.
Plazo de entrega de resultados
- El mínimo necesario para la realización de los cultivos (48 a 72 horas).
Formulario con características del producto y variables para las pruebas
En caso de solicitar la realización de las pruebas debe remitirnos con el producto el formulario correspondiente cumplimentado.
El volumen mínimo de agua requerida es de 200 mL (100 mL para cada uno de los tipos de colifagos).
Si el agua está clorada, debe tratarse con 1 a 3 mg/litro de tiosulfato sódico para eliminar el cloro.
Conservación y envío de la muestra:
- Refrigerada (preferido) durante un tiempo máximo de 24 horas.
Coste de la prueba:
- Método EPA 1601 (Muestras aisladas)
- Método EPA 1602 (Muestras aisladas)
- Varias muestras recibidas simultáneamente
- Consultar a ivami@ivami.com