Leishmania spp.- Leishmaniosis en humanos y perros: diagnóstico molecular (PCR en tiempo real; Identificación de especie por secuenciación; Anticuerpos)
Información 27-02-18.
Las leishmaniosis son un conjunto de manifestaciones clínicas producidas por un protozoo parásito del género Leishmania, que se transmite a los humanos por la picadura de flebótomos hembra infectados. La leishmaniosis es la tercera enfermedad transmitida por vectores más importante del mundo. Su distribución geográfica está condicionada por la distribución de sus vectores y su sensibilidad al frío, y engloba la Cuenca del Mediterráneo, Asia Sudoriental, África Oriental y Norte, y Centro y Sudamérica, siendo endémica en 88 países. A pesar de los avances obtenidos por los programas de eliminación de la enfermedad en los principales países endémicos, la carga de esta enfermedad se ha incrementado en la última década debido a la migración de humanos y perros infectados, la nueva distribución geográfica del insecto por el calentamiento global, la coinfección con enfermedades inmunosupresoras y las condiciones higiénico-sanitarias. La Organización Mundial de la Salud estima que cada año se producen entre 700.000 y un millón de nuevos casos y entre 20.000 y 30.000 defunciones. La leishmaniosis es principalmente una zoonosis canina, por lo que su estudio y diagnóstico tiene importancia tanto en la medicina veterinaria como en la humana.
Se han descrito 53 especies de Leishmania, clasificadas en cinco subgéneros y complejos: Leishmania, Viannia, Sauroleishmania, el complejo L.enrietti, y Paraleishmania. Entre ellas, 31 especies son parásitos de mamíferos y 20 especies, incluidas en los géneros Leishmania y Viannia, son patógenas para los seres humanos.
Leishmania spp. causa cuatro principales formas clínicas, dependiendo de la localización de los parásitos en los tejidos: la leishmaniosis cutánea, cutánea difusa, mucocutánea, y visceral. El estado de salud del hospedador y su genética influencian la forma de la enfermedad, pero el principal determinante del tropismo y la patología de la infección es la especie de Leishmania infectante.
Los diferentes cuadros clínicos son causados por diferentes especies de Leishmania en el Viejo y Nuevo Mundo. El subgénero Viannia (L. braziliensis, L. guyanensis, L. panamensis, L. naiffi, L. shawi, L. lainsoni, y L. peruviana) y el complejo L. mexicana (L. mexicana, L. amazonensis, L. pifanoi, L. garnhami, y L. venezuelensis) causan leishmaniosis cutánea en el Nuevo mundo, mientras que L. major, L. tropica, y L. aethiopica son las especies responsables de la leishmaniosis cutánea en el Viejo Mundo. Entre ellas, las infecciones causadas por L. aethiopica y L. amazonensis pueden dar lugar también a la leishmaniosis cutánea difusa. Algunas de estas especies, principalmente L. braziliensis, y en menor medida L. guyanensis, L. panamensis, y L. amazonensis, pueden migrar a tejidos nasofaríngeos y causar leishmaniosis mucocutánea. La forma más grave de la enfermedad, la leishmaniosis visceral, es causada por dos especies del complejo L.donovani: L. donovani y L. infantum, llamadas también L.archivaldi y L. chagasi respectivamente en el Nuevo Mundo. También, se han informado de algunos casos de leishmaniosis visceral provocados por la infección de L. tropica y L. amazonensis.
El ciclo biológico de Leishmania comprende esencialmente el paso alternativo de un hospedador vertebrado a otro invertebrado, y viceversa, con dos formas morfológicas principales, la intracelular o amastigota que se localiza en las células del sistema fagocítico mononuclear del hospedador vertebrado, y la forma extracelular o promastigota localizada en el tracto intestinal de los artrópodos vectores, los flebótomos. Los flebótomos o moscas de la arena, son pequeños dípteros de 2-3 mm, de los que al menos 78 especies son vectores probados de la leishmaniosis. En el Nuevo mundo, las especies involucradas en la transmisión de la infección pertenecen a los géneros Lutzomyia, Nyssomyia, Psychodopygus, y Verrucarum, mientras que en el Viejo Mundo, se engloban mayoritariamente en los géneros Phlebotomus y Paraphlebotomus. El paso del parásito al vector tiene lugar cuando las hembras de los flebótomos ingieren sangre del hospedador vertebrado para alimentarse y poder desarrollar sus huevos. En el tubo digestivo del vector, Leishmania se multiplica bajo la forma amastigota, transformándose rápidamente a la forma promastigota, que se multiplica activamente en su estómago e intestino. Tras una fase paramastigota, los promastigotes metacíclicos, la forma infectante, se sitúan en la región bucal o trompa del vector, desde donde pasarán al hospedador vertebrado. A pesar de que estos dípteros son los vectores aceptados de la enfermedad, los dípteros Forcipomyia spp. y algunas especies de garrapatas como Rhipicephalus sanguineus han sido descritos como vectores potenciales de Leishmania.
La mayoría de las leishmaniosis son zoonosis en las que distintas especies animales salvajes y domésticas, fundamentalmente los cánidos y diferentes tipos de roedores, actúan como reservorio del parásito para su posterior propagación al hombre a través de los flebótomos. Sin embargo, en algunas formas de leishmaniosis el hombre puede también actuar como único hospedador vertebrado. El ciclo en el hospedador vertebrado comienza cuando el flebótomo inocula mediante su picadura los promastigotes infectantes o metacíclicos. Los promastigotes son captados por los macrófagos de la dermis y, en el citoplasma, son englobados en una vacuola parasitófora donde se transforman a forma amastigota. En el interior de los macrófagos, los amastigotes pueden ser destruidos por los metabolitos oxigenados y por las hidrolasas lisosomales, si no es así, los parásitos se dividen activamente hasta que la célula estalla. Dependiendo de la forma de leishmaniosis, los parásitos libres pueden ser captados por otro macrófagos de la zona repitiéndose el proceso multiplicativo, diseminarse directamente a través de la piel o de la circulación cutánea hasta alcanzar las mucosas, o bien ser arrastradas por el torrente sanguíneo y linfático con los macrófagos, localizándose en los órganos linfáticos, principalmente médula ósea, hígado y bazo. En los humanos, cuando la invasión de Leishmania spp. queda limitada a los macrófagos de la zona de la picadura, se presenta el cuadro clínico de la leishmaniosis cutánea, conocida también como Botón de Oriente. La leishmaniosis cutánea, es la forma más frecuente de la enfermedad, y produce en las zonas expuestas del cuerpo infecciones localizadas con una o varias lesiones cutáneas, sobre todo ulcerosas, que dejan cicatrices de por vida. En la mayoría de los casos puede resolverse espontáneamente, aunque la duración del proceso es prolongada (meses o años). Si por el contrario, se produce una débil respuesta inmunitaria y no tiene lugar el aislamiento de la lesión primaria por una barrera linfocítica, el parásito se extiende sobre toda la superficie cutánea produciéndose la leishmaniosis cutánea difusa, caracterizada por la formación de placas, pápulas y/o nódulos principalmente en la cara y las extremidades. La metástasis de los parásitos hacia las mucosas origina la leishmaniosis mucocutánea o espundia, que causa ulceración y erosión del tejido blando y del cartílago de las zonas afectadas, principalmente la zona nasal pero también la faringe, laringe y labio superior, pudiendo ser altamente deformativa. Por último, la visceralización del parásito se conoce con el nombre de leishmaniosis visceral o Kala-azar. Esta forma clínica suele afectar a niños, personas en estado de malnutrición y pacientes con algún tipo de inmunodepresión y, si no se trata, es mortal en más del 95% de los casos. Se caracteriza por episodios irregulares de fiebre, pérdida de peso, hepatoesplenomegalia y anemia. Los principales órganos afectados son el bazo, hígado, médula ósea y tejido linfático, pero puede haber afectación de otras áreas como pueden ser los pulmones y la mucosa intestinal. En los órganos afectados se forman pequeños granulomas que dañan las vísceras al causar hiperplasia e hipertrofia de los mismos, congestión de los vasos sanguíneos, necrosis de los tejidos y alteraciones de su funcionamiento normal. Además, la importante respuesta humoral da como resultado la aparición de inmunocomplejos circulantes que a veces se depositan en los riñones causando glomerulonefritis.
En la Cuenca Mediterránea, L.infantum es el agente responsable de la forma cutánea y visceral de la leishmaniosis en humanos, siendo los casos declarados fundamentalmente viscerales, la mayoría de ellos en enfermos infectados por el VIH. L. infantum se asocia con un ciclo zoonótico donde los perros son considerados los principales hospedadores del parásito y el principal reservorio de la infección canina y humana. Cabe añadir, que L. infantum puede provocar también leishmaniosis cutánea en gatos y caballos, siendo la leishmaniosis felina una enfermedad cada vez más reconocida en las zonas endémicas. La leishmaniosis canina es endémica en la Cuenca Mediterránea, siendo la seroprevalencia media de L. infantum en el Sur de Europa en perros domésticos de hasta el 25%. En los perros, la infección por L.infantum tiene un periodo de incubación que varía de meses a años y el cuadro clínico comprende un espectro que va desde la infección subclínica a la leishmaniosis canina, una enfermedad severa, crónica, sistémica, e incluso fatal. La resistencia se asocia con el desarrollo de inmunidad celular, y la mayoría de los perros infectados no enferman. Las manifestaciones clínicas más frecuentes son linfoadenomegalia, alteraciones cutáneas, anorexia, lesiones oculares, cojera, debilidad, pérdida de peso, caída del pelo, epistaxis, anemia, y disfunción renal.
El diagnóstico de laboratorio de las leishmaniosis se basa, generalmente, en la aplicación conjunta de métodos de diagnóstico directos e indirectos, variando éstos en función del cuadro clínico. El diagnóstico directo se realiza principalmente mediante la observación del parásito al microscopio previa tinción con los colorantes habitualmente empleados en hematología. También, puede realizarse el cultivo, inoculación en animales de laboratorio, xenodiagnóstico, y la detección de antígenos por Western blot, o del ADN mediante PCR. Entre los métodos indirectos, destaca la intradermorreacción de Montenegro y el diagnóstico serológico de la leishmaniosis visceral. Actualmente, la detección del ADN del parásito mediante PCR es una de las técnicas más ensayadas debido a su gran sensibilidad y rapidez. El diagnóstico serológico es también un método útil en la leishmaniosis visceral en pacientes inmunocompetentes, pero no en pacientes inmunodeprimidos. L. infantum, la especie endémica en el área Mediterránea, presenta un importante polimorfismo enzimático y, en el laboratorio, la identificación de los diferentes zimodemas constituye una útil herramienta taxonómica que contribuye al estudio de la epidemiología del patógeno. En humanos, los diferentes zimodemas pueden ser considerados dermotropos, viscerotropos, o causantes de ambas formas de leishmaniosis, y también, ser más asociados a individuos inmunocompetentes o inmunodeprimidos. Además, la comparación de especies mediante PCR-RFLP permite diferenciar cepas de L. infantum, constituyendo un método útil para comparar dos cepas de diferentes orígenes, o dos muestras del mismo sujeto para diferenciar entre recaída o reinfección.
Pruebas realizadas en IVAMI:
- Detección molecular (PCR en tiempo real) de Leishmania spp. mediante la amplificación del gen AAP3 en humanos y animales.
- Identificación de Leishmania spp. a nivel de especie (PCR y secuenciación)
- Detección de anticuerpos frente a L. infantum en humanos y perros.
Muestra recomendada:
- Para el diagnóstico de leishmaniosis tegumentarias las muestras recomendadas son las obtenidas de lesiones activas de la piel o mucosas. En las lesiones ulceradas, la obtención de muestra debe realizarse en los bordes de la lesión o en el fondo de la úlcera, después de eliminar la zona superior necrosada. La toma de muestras puede realizarse mediante un raspado de la lesión, aspiración con aguja, biopsia con aguja, o con un punch.
- Para el diagnóstico de la leishmaniosis visceral, el método de muestreo más utilizado por su facilidad y sensibilidad es el aspirado de médula ósea. El parásito también puede buscarse en leucocitos de sangre periférica.
- Para el diagnóstico serológico en individuos inmunocompetentes debe enviarse suero o plasma (2 ml), o sangre periférica completa extraída con EDTA (5 ml) para la posterior separación del plasma en nuestro laboratorio.
Conservación y envío de la muestra:
- Refrigerada (preferido) durante menos de 2 días.
- Congelada: más de 2 días.
- En el caso de enviar sangre completa extraída con EDTA para el diagnóstico serológico la muestra no debe ser congelada.
Plazo de entrega de resultados:
- Detección molecular (PCR en tiempo real) de Leishmania spp. mediante la amplificación del gen AAP3: 24 a 48 horas.
- Identificación de Leishmania spp. a nivel de especie (PCR y secuenciación): 48 a 72 horas.
- Detección de anticuerpos frente a L. infantum: 48 a 72horas.
Coste de la prueba:
- Detección molecular (PCR en tiempo real) de Leishmania spp. mediante la amplificación del gen AAP3: consultar a ivami@ivami.com
- Identificación de Leishmania spp. (PCR y secuenciación): : consultar a ivami@ivami.com
- Detección de anticuerpos frente a L. infantum: consultar a ivami@ivami.com