Hepatitis C: polimorfismo Q80K de la proteasa NS3 de virus de hepatitis C genotipo 1a; polimorfismo D168A/H/T/V/Q de virus de hepatitis C genotipo 3; y mutaciones de resistencia a fármacos antivirales: RT-PCR y secuenciación .

Información (29-07-14)

La infección por virus de hepatitis C (VHC) afecta al hígado, provocando en el 50 a 85% de los casos una infección crónica, de los que el 2 a 20% evolucionan a cirrosis hepática después de 20 a 30 años de evolución, y de ellos una proporción pequeña harán un fracaso hepático o un carcinoma hepatocelular, y son candidatos a un trasplante hepático. Muchos de los individuos infectados son asintomáticos pero son infecciosos, por lo que pueden transmitir el virus a nuevos individuos.

El virus de la hepatitis C, posee varias regiones genómicas bien conocidas: 5´-NCR-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4A-NS5A-NS5B-NCR-3´, codificantes de la cápside (C ), proteínas de envoltura (E1, E2), proteasa (NS3), cofactor de la proteasa, helicasa y ATPasa (NS4A), proteína de fijación (NS4B), regulador de replicación (NS5A), polimerasa viral RNAp-RNAd (NS5B). Según la variabilidad de nucleótidos a lo largo de toda su secuencia se diferencia en 6 genotipos cuando las diferencias existentes son del 30 a 35% de su secuencia nucleotídica. Cada uno de los 6 genotipos puede diferenciarse en subtipos, cuando en un geotipo existen diferencias en la secuencias nucleótídicas del 20 a 25% de su secuencia. Además, dentro de cada subtipo pueden diferenciarse variantes cuando existen entre ellas diferencias de un 5 a 8%.

Hasta hace poco, las únicas alternativas terapéuticas han sido el interferón α (PegIFN: interferón pegilado), asociado o no a ribavirina. Actualmente existen varios grupos de fármacos antivirales, algunos de ellos ya disponibles y otros en fase de desarrollo. Algunos de estos nuevos fármacos, por ejercer su efecto directamente inhibiendo algún mecanismo propio de la replicación del virus, se denominan “inhibidores directos” de la replicación viral. Estos nuevos fármacos se pueden subdividir en a) Inhibidores de proteasa NS3/4A, porque inhiben esta proteasa necesaria para la replicación (lineales con α-ketoamida: telaprevir, boceprevir; macrocíclicos: simeprevir, asunaprevir, vaniprevir, danoprevir: tripeptídicos lineales: faldaprevir; y otros ABT-450r, GS-9256); b) Inhibidores de la polimerasa viral NS5B, tanto análogos de nucleósidos (mericitabina, GS-7977, IDX-184), como no-nucleósidos (filibuvir, GS-9190, BI-7127, ANA-598, VX-222 y ABT-333); y c) Inhibidores no-nucleósidos de la región reguladora NS5A (daclatasvir).

La terapia actual de la infección crónica por virus de hepatitis C genotipo 1a, está basada en la combinación de un inhibidor de la proteasa NS3/4A, junto con peginterferón α y ribavirina. Esta terapia está recomendada para pacientes con infección crónica compensada, incluidos los casos que hayan evolucionado a cirrosis que no hayan sido tratados o que hayan fracasado con la terapia de interferón aislado o asociado a ribavirina. 

Polimorfismo Q80K y respuesta terapéutica a los inhibidores de proteasa

Los ensayos clínicos con los nuevos inhibidores de segunda generación demostraron que su eficacia está relacionada con la ausencia del polimorfismo Q80K (cambio del aminoácido glutamina –Q- por el aminoácido lisina –K-) en la secuencia de la proteasa codificada por la región genómica NS3 del virus.

De los inhibidores de la proteasa NS3/4A citados, los tres más desarrollados son: boceprevir (VictrelisR, Schering Corp/Merck & Co. Inc.), telaprevir (IncivekR, Vertex Pharmaceuticals Inc.) y el de segunda generación de estructura macrocíclica simeprevir (OlysioR, Janssen Therapeutics). Estos inhibidores de la proteasa NS3/4A, están recomendados para el tratamiento de la infección por virus de hepatitis C, genotipo 1.

Para determinar la eficacia antiviral de un fármaco, la mejor evaluación se realiza a través de la respuesta virológica sostenida (SVR: Sustained Virologic Response), es decir que no se puede detectar la presencia del virus, considerándose que el paciente está curado.

La eficacia de la terapia con los nuevos inhibidores de proteasas de hepatitis C, de estructura macrocíclica (e.gr. simeprevir), es elevada (84%), cuando no existe en la secuencia viral de NS3, el polimorfismo Q80K. El polimorfismo significa que en una secuencia determinada de nucleótidos, existe una diferencia que implica un cambio de aminoácido en la secuencia de una proteína.

En EE.UU. se ha encontrado que un 48% de los casos de infección por virus de hepatitis C genotipo 1a, posee el polimorfismo Q80K, por lo que la FDA americana recomienda que se realice una prueba de selección (“screening”) antes de iniciar la terapia con los inhibidores de la proteasa NS3/4A de estructura macrocíclica (e.g. simeprevir), ya que cuando existe este polimorfismo, se reduce la eficacia estos fármacos. En Europa la prevalencia de este polimorfismo Q80K, es inferior (19%).

Por las razones citadas, el polimorfismo Q80K, sólo está justificado determinarlo en los pacientes con infección por virus de hepatitis C genotipo 1a, ya que cuando el virus posee este cambio de aminoácidos (sustitución de glutamina –Q-, por lisina –K-, en posición 80), en la proteasa NS3/4A, se reduce la eficacia terapéutica con los inhibidores de proteasas de estructura macrocíclica (e. gr. Simeprevir). Sin embargo, la presencia de este polimorfismo, no afecta a la actividad de los inhibidores de la proteasa NS3/4A, con α-ketoamida en su estructura (e.gr. boceprevir o telaprevir), o de estructura tripeptídica lineas (e.gr. falsaprevir).

En los virus de hepatitis C, genotipo 3, existe el polimorfismo D168A/H/T/V/Q, que también reduce la actividad de los inhibidores de la proteasa NS3/4A de estructura macrocíclica (e.gr. simeprevir).

Mutaciones de resistencia a los nuevos fármacos antivirales para la infección crónica por VHC

La elevada tasa de replicación de VHC, junto con la escasa fidelidad y corrección de errores de su polimerasa (RNAdRNAp: HCV-RNA-dependent-RNA-Polymerase) genera una población viral con una secuencia nucleótidica muy variada (“quasispecies”). Las diferencias en la secuencia nucleotídica implica sustitución en las secuencias de aminoácidos que puede resultar en la ausencia de respuesta a la terapia con fármacos que tengan como diana esa proteína (e.gr. proteasa viral, polimerasa viral, …). Bajo la administración de un fármaco antiviral se promueve la selección terapéutica, por lo que la variante resistente puede convertirse en la población viral mayoritaria, conduciendo al fracaso terapéutico. De ahí la necesidad de combinar varios fármacos, como la recomendación actual de utilizar pegIFN asociado a ribavirina y un inhibidor de la proteasa NS3/4A, para evitar el desarrollo de resistencia.

En el caso de los inhibidores de la proteasa, se conocen varias mutaciones que confieren disminución o pérdida de sensibilidad, unas de ellas que afectan a la mayoría de los fármacos (e.gr. V36A/M, T54A/V/S, R155T/K, A156S/T/S/V, V170A/T/L), otras que afectan a los inhibidores que poseen en su estructura α-ketoamida que forma un enlace covalente reversible con el núcleo catalítico de serina de la proteasa (e. gr. boceprevir y telaprevir), y otras mutaciones (D168V/A/T/H, A156S/V), que afectan a los inhibidores de estructura tripeptídica lineal que se unen de forma no-covalente (e.gr. faldaprevir) y otras que afectan la los compuestos macrocíclicos (e.gr. simeprevir). 

Principales mutaciones conocidas:

Mutaciones conocidas que afectan a los inhibidores de proteasa NS3/4A:
V36A/M,  T54A/V/S, V55A, Q80K, R155T/K, A156T/S/V, D168V/A/T/H, V170A/T/L.

Mutaciones que afectan a los no-nucleósidos inhibidores de NS5A:
M28T, Q30H/R, L31M/F/V, P32L, Y93C/H/N.

Mutaciones que afectan a los nucleósidos inhibidores de la polimerasa NS5B:
S282T.

Mutaciones que afectan a los no-nucleósidos inhibidores de polimerasa NS5B:
C136Y/N, S365T/A, M414T/L, L419M/V, M423T/I/V, Y448C/H, I482L/V/T, M494I/A, P495S/L/A/T, P496A/S, V499A.

Pruebas realizadas en IVAMI:

• Amplificación por RT-PCR y secuenciación de la región NS3 (polimorfismo Q80K y mutaciones de resistencia a inhibidores de proteasas).
• Amplificación por RT-PCR y secuenciación de la región NS5A (mutaciones de resistencia a inhibidores de NS5A).
• Amplificación por RT-PCR y secuenciación de la región NS5B (mutaciones de resistencia a inhibidores de la polimerasa).
 

Muestra recomendada: 

Polimorfismo Q80K

• Plasma o suero, con carga viral a ser posible ≥ 1.000 UI/ml de VHC, genotipo 1a. 

Mutaciones de resistencia a inhibidores de NS3 (proteasa), NS5A (inhibidores de NS5A), o NS5B (inhibidores de la polimerasa)

• Plasma o suero con carga viral a ser posible ≥ 1.000 UI/ml de VHC.

Conservación y envío de la muestra:
 
• Refrigerada (preferido; puede ser plasma separado o sangre completa) durante menos de 2 días.
• Congelada (sólo en caso de plasma separado de sangre completa): más de 2 días.

Plazo de entrega de resultados:

 2 a 4 días.

Coste de las pruebas:  

Consultar a ivami@ivami.com